米乐M6官网登录正版下载·前列腺特异性膜抗原是前列腺癌新辅助强化雄激素剥夺治

　　抗PSMA是治疗后前列腺肿瘤的可靠标志物，更广泛地利用这种染色剂可以通过更准确地量化其残余肿瘤负担来识别将从强化辅助治疗中受益的患者。

　　新辅助性强雄激素剥夺治疗 （iADT） 可产生广泛的组织学反应，这些反应又反映在最终的前列腺切除术标本中。准确识别和测量残留肿瘤体积对于跟踪和分层患者预后至关重要。材料和方法：本研究的目的是评估抗前列腺特异性膜抗原（PSMA）抗体在根治性前列腺切除术前接受iADT加恩杂鲁胺治疗6个月的35例患者中特异性检测残留肿瘤的能力。结果：31例患者发现残余癌，PSMA均对肿瘤反应积极。PSMA染色对肿瘤的敏感性为96%，约82%的良性区域没有反应性。相比之下，在37例未经治疗的对照队列中，PSMA对72%的良性区域有积极反应，导致肿瘤特异性为28%。PSMA进一步确定了高度去分化的前列腺癌，包括具有神经内分泌分化证据的肿瘤。结论：我们建议抗PSMA免疫染色成为iADT环境中识别残留癌症的标准化标志物。

　　中高风险局限性前列腺癌的确定性治疗策略包括手术或放疗。然而，由于生化复发率 （BCR） 为 15%-30%，在手术前使用涉及激素、化疗或精准药物的新辅助治疗可改善诊断时携带微转移疾病的不利风险患者亚组的结局。1–5强雄激素剥夺疗法（iADT）将雄激素受体（AR）途径靶向药物与常规促黄体激素释放激素激动剂相结合，在转移性，新诊断的激素敏感性前列腺癌中显示出很强的疗效;iADT 是局部晚期最常用的策略之一，作为新辅助全身治疗。尽管来自近期临床试验的数据尚未成熟，无法确定总体生存获益，但接受新辅助 iADT 的患者的一部分患者根据相对于历史对照组预计复发的时间，显示 BCR 存在显著延迟。7,8事实上，“特殊应答者”（ER）患者携带最小残留疾病（MRD），或新辅助治疗后完全病理应答，其定义为最大横截面尺寸0.25-0.5cm，或0.05-0.25cm3按体积计算，3年BCR无率大于95%，因此残余癌症体积已成为新临床研究的主要结果。8作为“不完全响应者”或“无响应者”（INR，大于MRD）的定义8基于手术后对前列腺切除组织进行细致的检查，对剩余癌细胞的准确定量，建议将各种免疫染色与苏木精和曙红（H&E）染色结合使用。

　　在这项研究中，我们假设针对前列腺特异性膜抗原（PSMA）的免疫组织化学（IHC）将是检测新辅助iADT后残留前列腺肿瘤的敏感和特异性标志物。我们表明，用AR靶向新辅助治疗治疗6个月的前列腺肿瘤保持高水平的PSMA表达，而良性腺体则没有。因此，与一系列未经治疗的对照相比，IHC对PSMA的治疗后肿瘤细胞的特异性几乎是其3倍。PSMA表达在经历了3种不同形式的神经内分泌分化的病例中也保留。因此，我们建议将抗 PSMA IHC 视为在新辅助 iADT 情况下测量残余癌症体积的标准组织学标志物。

　　美国国立卫生研究院机构审查委员会批准在手术前收集和分析接受雄激素剥夺治疗（ADT）加恩杂鲁胺治疗的高危局限性前列腺癌患者的组织和人口统计数据（IRB方案No. 15-c-0124）。仅通过手术治疗的局限性前列腺癌患者的组织和人口统计数据的收集和分析已获得Beth Israel Deaconess医疗中心（IRB协议编号2010-P-000254/0）和Dana-Farber/Harvard癌症中心（IRB协议编号15-008和15-492）的机构审查委员会的批准。所有患者在参与前都提供了知情同意。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》的原则进行的。

　　切除后，对根治性前列腺切除术标本进行粗略检查，然后根据标准程序对福尔马林固定和石蜡包埋。将五微米连续的组织切片安装在带电载玻片上进行染色或直接用于RNA的回收。福尔马林固定和石蜡包埋的载玻片使用标准方案用H&E染色。如前所述，对治疗病例的残留肿瘤进行定量。10,11抗PSMA IHC使用Dak M3620在1：500稀释下进行。补充材料（）中提供了实验室方法的更多详细信息。

　　将3 mm×3 mm网格覆盖在每个组织切片上，以将组织划分为方形感兴趣区域（ROI）进行分析。使用HALO®图像分析平台（新墨西哥州阿尔伯克基的Indica Labs）进行网格划分。每个区域都通过PSMA染色和该区域的肿瘤存在进行分类，使用每个ROI中染色或未染色的上皮的总面积对每个网格进行单独分类，不包括腔腔空间。如果ROI内的大部分肿瘤PSMA呈阳性，并且大多数阳性是肿瘤，则该区域被归类为“真阳性”。如果ROI内的大部分肿瘤PSMA为阴性，或者如果阴性染色肿瘤多于阳性染色的非肿瘤，则该区域被归类为“假阴性”。如果一个区域的大部分染色阳性是非肿瘤的，则该区域被归类为“假阳性”。如果一个区域内没有肿瘤或染色阳性，则将其归类为“真阴性”。ROI的分类由董事会认证的专家前列腺病理学家（R.T.L.）验证。用于自动图像分析的方法在补充材料（）中提供。

　　使用Mac的GraphPad Prism版本9（GraphPad Software，加利福尼亚州圣地亚哥）进行统计分析，使用Pearson或Spearman相关性测量因子之间的关联。使用Welch的t检验对治疗和未治疗的肿瘤之间，肿瘤和非肿瘤区域之间或ER和INR病例之间的单一因素进行比较。使用2侧Fisher的精确检验对已治疗或未治疗的肿瘤与个体二分法因素之间的富集进行零假设检验。使用Cochran-Armitage测试进行已治疗和未治疗肿瘤之间单一因素内协变量的比较。PSMA IHC用于区分INR和ER病例的准确性使用接收器工作特性曲线进行检查。统计学显著性在 p 0.05 处预先指定。对于已治疗和未治疗的病例，报告了基于网格的检测性能，置信区间为95%，通过随机抽样置换患者的2，000个自举样本的2.5%和97.5%百分位数获得。补充材料（）中提供了RNA-seq分析的详细方法。

　　作为2期临床试验的一部分，我们在35名患者的队列中评估了6个月的全身性新辅助iADT后前列腺切除术标本中残留肿瘤的存在。10虽然H&E染色通常足以检测患者的大部分残留腺癌，但在一小部分病例中进行了抗NKX 3.1或PIN-4鸡尾酒（高分子量细胞角蛋白，p63和α-甲基酰基- CoA消旋酶）的IHC，用于检测单个肿瘤细胞并精确计算治疗后肿瘤体积。11常见的前列腺癌标志物前列腺特异性抗原（PSA）和AR在一部分病例中由于iADT抑制AR而显示染色减少（图1，A和B），因此在这种治疗后环境中没有那么有用。在许多情况下，滑索标志物NKX 3.1的弥漫性染色鉴定出残留肿瘤（图1，A）。在几乎所有情况下，使用PSMA抗体进行免疫染色都显示出残留肿瘤的强而一致的染色（图1，A和B）。在这些治疗后肿瘤中，抗PSMA IHC在良性腺体中较弱（图1，C）。相比之下，来自未接受ADT治疗的患者的前列腺切除术标本在良性和肿瘤腺中均显示出更强的PSMA染色（图1，D）。

　　图 1.前列腺肿瘤的代表性全玻片和插入显微照片。A、抗PSMA残留肿瘤阳性，抗PSA阴性，抗NKX阳性3.1。B，抗PSMA残留肿瘤阳性，抗AR弥漫性弱。C，显示的良性腺体区域与PSMA阳性残留肿瘤细胞相邻的抗PSMA阴性。D，未经治疗的前列腺切除组织，良性（顶部）和肿瘤（底部）腺体均染色阳性，以抗PSMA。显示H&E以供参考。全幻灯片图像条：5毫米;插入条：100 μm。

　　鉴于PSMA蛋白的放射性标记配体现在可用于体内肿瘤定位的正电子发射断层扫描（PET），我们询问我们通过IHC检测残留肿瘤是否会模仿PSMA-PET的潜在检测。我们将每个案例缩减采样到3 mm×3 mm网格中以接近PET的分辨率，我们设计了一个简单的评分方案来系统地测试队列。这些 9 毫米2含有肿瘤的ROI区域要么被标记为PSMA阳性染色（真阳性）或未染色（假阴性;图 2，A）。同样，没有肿瘤的区域可以被PSMA染色（假阳性）或未染色（真阴性）。这种网格化方案的一个例子如图2所示，B和这种评分方法与常规的半定量H评分成比例，分别是良性和肿瘤成分（参见补充材料中的补充图，）。

　　图 2.前列腺肿瘤组织评分进行PSMA染色。A、将ROI的颜色编码转换为9 mm2网 格。B、以整座治疗前列腺组织为例进行网格化和评分。C和D，来自已治疗 （C） 或未经治疗 （D） 前列腺肿瘤的代表性 ROI。插图条：100 μm。E和F，可视化已治疗 （E） 或未治疗 （F） 队列中 ROI 的分布，对每位患者进行归一化。G和H，皮尔逊从手动分析中确定的阳性染色区域（肿瘤和非肿瘤）的比例，每个患者，与来自处理（G）或未处理（H）队列的相同组织块的序列载玻片的本体RNA测序中FOLH1的解卷积腔细胞表达的计数的百万分之一。线% 置信区的线性回归趋势。

　　在我们完成治疗的37名患者的队列中，有1个标本在处理过程中遇到延迟，不适合IHC。第二名患者接受了经尿道前列腺切除术而不是前列腺切除术，留下35个治疗的前列腺切除术标本进行分析。对于对照组，我们收集了一组37名中高风险前列腺癌患者，仅通过手术治疗（表1）。然而，由于iADT试验选择的风险高于通常仅通过手术治疗的患者，因此治疗队列中较高的格里森等级组是不可避免的（表1）。每个可能分数的代表性投资回报率如图2、C和D所示。

　　韦尔奇的 t 检验。费舍尔的精确测试。Cochran-Armitage趋势测试。队列之间的主要差异是每张载玻片的肿瘤体积（表1），治疗队列中含有肿瘤的ROI要少得多（25%对41%，图2，E和F）。应用我们的视觉评分算法，治疗队列中的大多数ROI是未染色的非肿瘤（图2，E），而未经治疗的队列中最例的ROI是染色的非肿瘤（图2，F）。在治疗的队列中，85%的ROI显示PSMA染色对肿瘤具有特异性（图2，E），而在未经治疗的队列中为54%（图2，F）。治疗肿瘤的敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值也都更高（表2）。治疗队列的总阳性染色分数（包括线%。

　　为了正交地证实这一发现，我们从每个块的连续载玻片（包括良性和肿瘤腺，带有基质细胞）中收集了整个组织，并进行了全转录组测序。在两个队列中对每个病例进行RNA-seq。然后将这些本体转录组解卷积以获得腔内上皮细胞特异性基因估计值，而无需区分肿瘤和良性细胞类型。在每个样本的基础上，我们将抗PSMA阳性染色评分与编码PSMA的基因FOLH1（叶酸水解酶1）的相应表达值相关联。这些关联在两个队列（图2，G和H）中均为强阳性，治疗队列的Pearson相关系数（r）为0.67（95%C.I.0.43-0.82），未经治疗的队列为0.67（95%C.I.0.44-0.81）。因此，我们对组织中PSMA蛋白表达的组织学和低分辨率估计与mRNA表达得出的值成正比，从而验证了IHC评估PSMA上皮细胞表达的准确性。

　　由于治疗效果，治疗队列中含有的肿瘤总是较少，并且含有任何肿瘤的ROI的比例明显低于未经治疗的队列（图3，A，p = 0.006，Welch的t检验）。在这两个队列中，准确率和PPV与载玻片上肿瘤的数量成比例地增加（图3，B），未经治疗的肿瘤通过Pearson相关性显示出更强的比例关系（分别为r= 0.80和r= 0.92）。接下来，我们从10个不同病例中随机选择10个肿瘤和良性腺体的ROI上采用HALO自动图像分析平台，并开发了一种细胞分析算法来量化每个细胞的染色强度（图3，C）。在每 9 毫米内2ROI，单个PSMA染色的肿瘤细胞比PSMA染色的非肿瘤细胞具有更大的染色面积和染色强度（图3，D）。因此，我们的缩减采样分析更有可能低估相对于每个细胞的精确注释的准确性和特异性。

　　图 3.评估影响抗PSMA检测肿瘤细胞准确性的因素。。